Ingegneria interfacciale covalente di nanoparticelle di silice mesoporosa per l'ottimizzazione del rilascio del plasmide PRPF31-GFP mediato da PEI nella terapia genica retinica

This thesis investigates the development of non-viral nanocarriers for gene therapy, with a specific focus on the delivery of the PRPF31-GFP plasmid for the treatment of Retinitis Pigmentosa type 11 (RP11), a genetic retinal disorder associated with insufficient expression of the PRPF31 splicing factor. Although viral vectors remain the benchmark for gene delivery, their limitations, including immunogenicity, safety concerns, and restricted cargo capacity, have prompted the exploration of alternative platforms such as mesoporous silica nanoparticles (MSiNPs). The primary objective of this work is to design, synthesize, and evaluate MSiNPs-based delivery systems with tailored interfacial properties to optimize the balance between transfection efficiency and biocompatibility. The central hypothesis posits that sequential surface functionalization, consisting of APTES-mediated amination, glutaraldehyde (GA) activation, and covalent polyethyleneimine (PEI) grafting, enables controlled interactions among the nanoparticle carrier, the polymer, and the PRPF31-GFP plasmid, thereby enhancing delivery performance. The methodological approach integrates sol–gel templating for nanoparticle synthesis with stepwise chemical modification to generate three distinct platforms: aminated MSiNPs, polyplex-loaded systems, and fully covalent PEI-coated core–shell nanoparticles. Comprehensive physicochemical characterization was performed using transmission electron microscopy (TEM), energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX), dynamic light scattering (DLS), zeta potential analysis, and Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR). Biological evaluation in HEK293 cells was conducted via flow cytometry, fluorescence microscopy, and Western blotting to assess transfection efficiency and protein expression. The results demonstrate the successful synthesis of monodisperse, calcium-doped MSiNPs (diameter of ~140 nm) with a dendritic mesoporous architecture and effective sequential functionalization, as evidenced by the progressive surface charge inversion and increased organic content. Covalent PEI coating improved colloidal stability and dispersion properties. However, despite favorable physicochemical characteristics and confirmed cytocompatibility, biological performance remained limited. These findings indicate that suboptimal nanoparticle-to-DNA complexation ratios and pre-transfection aggregation critically impaired cellular uptake and gene expression. In conclusion, although the engineered MSiNPs-PEI system exhibits the structural and chemical prerequisites for gene delivery, its overall effectiveness is constrained by process-related limitations, underscoring the need for further optimization of formulation parameters to achieve functional transfection outcomes.

Questa tesi indaga lo sviluppo di nanovettori non virali per la terapia genica, con particolare attenzione al rilascio del plasmide PRPF31-GFP per il trattamento della retinite pigmentosa di tipo 11 (RP11), una malattia genetica della retina associata a un'espressione insufficiente del fattore di splicing PRPF31. Sebbene i vettori virali rimangano il punto di riferimento per il rilascio genico, i loro limiti, tra cui l'immunogenicità, i problemi di sicurezza e la capacità di carico limitata, hanno spinto all'esplorazione di piattaforme alternative come le nanoparticelle di silice mesoporosa (MSiNP). L'obiettivo principale di questo lavoro è progettare, sintetizzare e valutare sistemi di rilascio basati su MSiNP con proprietà interfacciali personalizzate per ottimizzare l'equilibrio tra efficienza di trasfezione e biocompatibilità. L'ipotesi centrale postula che la funzionalizzazione sequenziale della superficie, consistente nell'aminazione mediata da APTES, nell'attivazione con glutaraldeide (GA) e nell'innesto covalente di polietilenimmina (PEI), consenta interazioni controllate tra il vettore nanoparticellare, il polimero e il plasmide PRPF31-GFP, migliorando così le prestazioni di rilascio. L'approccio metodologico integra la sintesi di nanoparticelle tramite stampaggio sol-gel con una modificazione chimica graduale per generare tre piattaforme distinte: MSiNP amminate, sistemi caricati con poliplex e nanoparticelle core-shell completamente rivestite di PEI covalente. La caratterizzazione fisico-chimica completa è stata eseguita utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX), la diffusione dinamica della luce (DLS), l'analisi del potenziale zeta e la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FT-IR). La valutazione biologica nelle cellule HEK293 è stata condotta mediante citometria a flusso, microscopia a fluorescenza e Western blotting per valutare l'efficienza di trasfezione e l'espressione proteica. I risultati dimostrano la sintesi di successo di MSiNP monodisperse, dopate con calcio (diametro di ~140 nm) con un'architettura mesoporosa dendritica e un'efficace funzionalizzazione sequenziale, come evidenziato dalla progressiva inversione della carica superficiale e dall'aumento del contenuto organico. Il rivestimento covalente con PEI ha migliorato la stabilità colloidale e le proprietà di dispersione. Tuttavia, nonostante le favorevoli caratteristiche fisico-chimiche e la confermata citocompatibilità, le prestazioni biologiche sono rimaste limitate. Questi risultati indicano che rapporti di complessazione nanoparticella-DNA subottimali e l'aggregazione pre-trasfezione hanno compromesso in modo critico l'assorbimento cellulare e l'espressione genica. In conclusione, sebbene il sistema MSiNP-PEI ingegnerizzato mostri i prerequisiti strutturali e chimici per il rilascio genico, la sua efficacia complessiva è limitata da problematiche legate al processo, sottolineando la necessità di un'ulteriore ottimizzazione dei parametri di formulazione per ottenere risultati di trasfezione funzionali.