Quando l’antisenso ha senso: targeting di una variante criptica di ABCA4 mediante oligonucleotidi splice-switching come approccio terapeutico per la malattia di Stargardt

Inherited Retinal Diseases (IRDs) are a clinically and genetically heterogeneous group of retinal dystrophies characterised by the progressive degeneration of photoreceptors and the Retinal Pigment Epithelium (RPE). Among these, Stargardt disease type 1 (STGD1) is the most common form of inherited juvenile macular dystrophy, caused by biallelic loss-of-function mutations in the ABCA4 gene. Despite the widespread adoption of Next Generation Sequencing (NGS) in clinical practice, the diagnostic yield for IRDs remains between 52% and 74%, largely due to the systematic exclusion of non-coding and synonymous variants from standard exome-based bioinformatic pipelines. This work functionally characterised the ABCA4 c.768G>T synonymous variant identified in homozygous state in a patient with a clinical diagnosis of IRD. The variant affects the last nucleotide of the exon 6 and the canonical donor splice site. By using a minigene assay in HeLa cells, we demonstrated that the variant activates a cryptic donor splice site located 35 bp downstream in intron 6, leading to aberrant partial intron retention that introduces a premature termination codon and leads to loss of the protein. Building on this molecular diagnosis, five splice-switching antisense oligonucleotides (ssASOs) targeting the cryptic donor splice site were designed and optimised in silico and validated in vitro first in the minigene system; subsequently the two most efficient ssASOs were assessed in patient-derived three-dimensional retinal organoids generated from hiPSCs. The tested ssASOs partially restored physiological splicing, achieving a rescue comparable to that obtained with a previously reported positive control ssASO targeting the same cryptic splice site. Additionally, 2’-O-methoxyethyl phosphorothioate (2’MOE/PS) chemistry demonstrated superior therapeutic efficacy compared to 2’-O-methyl phosphorothioate (2’OMePS). These results establish a complete pipeline, from variant discovery to personalised RNA-based therapy, validated in a disease-relevant human model, and underscore the clinical potential of ssASOs for inherited retinal diseases.

Le malattie retiniche ereditarie (IRD) sono un gruppo clinicamente e geneticamente eterogeneo di distrofie retiniche, caratterizzate dalla progressiva degenerazione dei fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Tra queste, la malattia di Stargardt di tipo 1 (STGD1) rappresenta la forma più comune di distrofia maculare giovanile ereditaria, causata da mutazioni bialleliche da perdita di funzione nel gene ABCA4. Nonostante la diffusa adozione del Next Generation Sequencing (NGS) nella pratica clinica, la resa diagnostica per le IRD rimane compresa tra il 52% e il 74%, principalmente a causa dell'esclusione sistematica delle varianti non codificanti e sinonime dalle pipeline standard di analisi dei dati esomici. In questo lavoro è stata eseguita la caratterizzazione funzionale della variante sinonima ABCA4 c.768G>T identificata in omozigosi in un paziente con diagnosi clinica di IRD. La variante è localizzata nell’ultimo nucleotide e fa parte del sito donatore di splicing canonico dell'esone 6. Mediante un saggio minigene in cellule HeLa, abbiamo dimostrato che la variante attiva un sito donatore criptico di splicing 35 bp a valle nell'introne 6, determinando una ritenzione parziale aberrante dell'introne e conseguente introduzione di un codone di stop prematuro e perdita della proteina. Sulla base di questa diagnosi molecolare, sono stati progettati e ottimizzati in silico cinque oligonucleotidi antisenso splice-switching (ssASO) mirati al sito donatore criptico di splicing, poi validati in vitro inizialmente nel sistema minigene; successivamente, i due ssASO più efficienti sono stati valutati in organoidi retinici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) del paziente. Gli ssASO testati hanno parzialmente ripristinato lo splicing fisiologico, con un'efficacia di correzione comparabile a quella della molecola ssASO di controllo positivo C+ precedentemente descritta, diretta contro lo stesso sito donatore criptico. Inoltre, la chimica 2'-O-metossietil fosforotioato (2'MOE/PS) ha dimostrato un'efficacia terapeutica superiore rispetto alla chimica 2'-O-metil fosforotioato (2'OMePS). Questi risultati definiscono una pipeline completa, dall'identificazione della variante alla terapia personalizzata basata su RNA, validata in un modello umano clinicamente rilevante, e sottolineando il potenziale clinico degli ssASO per le malattie genetiche rare della retina.