Leveraging Hi-C for Comprehensive Detection and Functional Characterization of Structural Variants

Abstract (It) L'Hi-C è una tecnica genome-wide per lo studio dell'organizzazione tridimensionale (3D) del genoma, che ha permesso l'identificazione dei Topologically Associating Domains (TAD). I TAD rappresentano le unità strutturali e funzionali fondamentali del genoma, delimitate da regioni note come TAD boundaries. In questo contesto, le varianti strutturali (Structural Variants, SV) possono avere un effetto non solo attraverso alterazioni del dosaggio genico, ma anche mediante la perturbazione dell'architettura tridimensionale (3D) della cromatina. Tutte le SV (bilanciate e non) che coinvolgono almeno un TAD boundary, un gene e/o un elemento regolatorio possono alterare l'architettura 3D del genoma e riorganizzare il contesto regolatorio del locus coinvolto, contribuendo così potenzialmente all’insorgenza di meccanismi patogenetici. Alla luce di queste evidenze, abbiamo applicato l'Hi-C a sei campioni derivati da diversi tipi cellulari (fibroblasti, n=2; linfoblastoidi, n=1; astrociti derivati da hiPSC, n=3) allo scopo di validare il potenziale della tecnologia Hi-C nella rilevazione delle SV e nella caratterizzazione del loro impatto sull'organizzazione 3D del genoma. I campioni presentavano diverse classi di SV, comprese varianti del numero di copie (CNV), riarrangiamenti bilanciati e riarrangiamenti genomici complessi. Le librerie Hi-C sono state generate e analizzate mediante pipeline standardizzate. Le heatmap di interazione sono state visualizzate con Juicebox (v2.17.00) e, per i loci selezionati, le mappe di contatto intracromosomiche sono state visualizzate come matrici triangolari (upper-triangle) ruotate di 45°. Le CNV sono state identificate mediante metodo di sottrazione (mappa del paziente – mappa del controllo), mentre le SV bilanciate sono state rilevate mediante il riconoscimento di specifiche signature nelle mappe Hi-C. Attraverso questo approccio, abbiamo confermato la robustezza e versatilità della tecnologia Hi-C nell’identificazione e caratterizzazione di CNVs, SV bilanciate e riarrangiamenti genomici complessi. L’analisi delle mappe Hi-C ha inoltre consentito di riconoscere e descrivere specifici pattern di interazioni ricorrenti associati a ciascuna classe di SV (Hi-C signature). Parallelamente, i nostri risultati supportano l’utilità dell’Hi-C nello studio delle conseguenze delle SV sull'organizzazione 3D del genoma e sulla struttura dei TAD. Nel complesso, i nostri risultati confermano l'Hi-C come approccio genome-wide per la rilevazione e la caratterizzazione di un ampio spettro di SV, incluse quelle non rilevabili mediante tecniche gold standard come l'MLPA e l'aCGH, fornendo al contempo informazioni sul loro impatto sull’architettura 3D del genoma e contribuendo così alla comprensione dei potenziali meccanismi patogenetici associati.

Abstract (En) Hi-C is a genome-wide technique for investigating three-dimensional (3D) genome organization and has enabled the identification of Topologically Associating Domains (TADs). TADs represent the fundamental structural and functional units of the genome, separated from each other by regions known as TAD boundaries. In this framework, structural variants (SVs) have emerged not only as drivers of gene dosage alterations but also as crucial disruptors of chromatin architecture. Both balanced and unbalanced SVs involving at least a TAD boundary, a gene and/or a regulatory element have the potential to alter the 3D architecture of the genome and rewire the regulatory landscape of the affected locus, thereby contributing to pathogenic mechanisms. In light of this evidence, we applied Hi-C to six samples derived from different cell types (fibroblasts, n=2; lymphoblastoid cell lines, n=1; hiPSC-derived astrocytes, n=3) to further investigate the potential of Hi-C for the detection of SVs and their functional outcomes on the 3D genome organization. The samples harbored different classes of SVs, including copy number variants (CNVs), balanced and complex genomic rearrangements. Hi-C libraries were generated and analyzed using standardized pipelines. Interaction heatmaps were visualized using Juicebox (v2.17.00) and, for selected loci, intra-chromosomal contact maps were displayed as 45°-rotated upper-triangle matrices. We identified CNVs using a subtraction-based approach, while balanced SVs were detected based on characteristic Hi-C interaction signatures. Through this approach, we validated Hi-C as a robust and versatile tool for the detection and characterization of a broad spectrum of SVs. Moreover, our results confirmed the ability of Hi-C to investigate the functional consequences of genomic rearrangements on the 3D genome organization and on the structure of TADs. Overall, our findings support Hi-C as a comprehensive genome-wide approach for the detection and characterization of a broad range of SVs, including those undetectable with gold standard techniques like MLPA and aCGH, while simultaneously providing insights into their impact on 3D genome architecture, thereby contributing to the understanding of potential associated pathogenic mechanisms.