Applicazione di metodologie sperimentali e computazionali per lo studio di circuiti sintetici programmati per inibire le resistenze antibiotiche

Il fenomeno della resistenza antimicrobica (AMR) è considerato dalla World Health Organization (WHO) come una delle più gravi minacce per la salute pubblica del XI secolo. Infatti, l'aumento drammatico degli agenti patogeni multi-resistenti, unito all’arresto della scoperta di nuove molecole più efficaci degli antimicrobici attualmente disponibili, impongono l’urgente esigenza di nuove strategie per affrontare questo problema. A tal proposito, presso il Laboratorio di Bioinformatica e Biologia Sintetica (BMS Lab) dell’Università degli Studi di Pavia è attualmente in corso un progetto di ricerca che si prefigge come obiettivo quello di sviluppare una terapia alternativa al trattamento antibiotico tradizionale: tale terapia prevede l’ingegnerizzazione di un microrganismo probiotico come strumento di delivery di un circuito sintetico basato su tecnologia CRISPRi capace di silenziare l’espressione delle resistenze antibiotiche nei batteri patogeni target. L’elevata versatilità della tecnologia CRISPRi, unita ad un efficiente piattaforma di trasferimento genico, consentono di progettare agenti antimicrobici selettivi in grado di inibire la trascrizione di una sequenza distintiva nel genoma del batterio bersaglio. Le attività sperimentali descritte nel presente elaborato di tesi si collocano all’interno di questo progetto e hanno riguardato due aspetti determinanti nella caratterizzazione della tecnologia implementata: l’analisi delle cellule capaci di sopravvivere al targeting del sistema CRISPRi (escaper) e l’ottimizzazione del protocollo sperimentale di coniugazione batterica al fine di incrementare l’efficienza di trasferimento del circuito sintetico CRISPRi nei batteri resistenti. Nel Capitolo 1 il problema della resistenza antimicrobica viene presentato attraverso una panoramica generale che pone una particolare attenzione sui seguenti aspetti: le cause che spingono l’evoluzione della resistenza antibiotica a livello globale ; l’impatto sulla società odierna; i limiti legati allo sviluppo di soluzioni efficaci nel contrastarne la diffusione; il contributo che la Biologia Sintetica e la tecnologia CRISPR possono fornire nel processo di sviluppo di terapie innovative e il riassunto dei principali lavori scientifici in cui, ad oggi, la tecnologia CRISPR è stata impiegata per la progettazione di agenti antimicrobici. In seguito, viene descritto il progetto di ricerca e le attività sperimentali condotte in questo lavoro di tesi, le quali hanno contribuito alla caratterizzazione della piattaforma CRISPRi precedentemente implementata. Nel Capitolo 2 vengono presentati i metodi con cui è stata affrontata l’analisi degli escapers. In particolare, lo studio di questa popolazione di cellule è stato affrontato mediante l’applicazione di tecniche sperimentali, volte ad indagarne le dinamiche temporali di crescita, e modelli computazionali, implementati con l’obiettivo di descrivere matematicamente la crescita di una popolazione batterica resistente esposta all’azione di antibiotici -lattamici. Nel Capitolo 3 vengono presentate le caratteristiche della piattaforma sintetica coniugativa basata su tecnologia CRISPRi sviluppata nel progetto di ricerca; in seguito, viene presentato il protocollo sperimentale applicato per caratterizzare quantitativamente la frequenza del trasferimento coniugativo e vengono discusse le strategie implementate per aumentare l’efficienza di coniugazione; infine, la Proof of Concept di un protocollo di coniugazione high-throughput viene dimostrata e descritta in funzione delle sue potenziali applicazioni future. Nel Capitolo 4 sono trattate le conclusioni finali ricavate dal lavoro di tesi e sono suggeriti gli sviluppi futuri del progetto di ricerca presentato.