A Step towards a directed structural connectome of the human brainstem: from tracer-based anatomical evidence to diffusion tractography

The brainstem is a structurally and functionally complex region of the human brain, containing numerous nuclei that give rise to widespread neuromodulatory and sensorimotor projections, reaching not only other brainstem nuclei but the whole brain, targeting cortical, subcortical and cerebellar regions. Its in-vivo connectivity can be investigated using diffusion MRI tractography that allows white-matter pathways to be reconstructed. However, the small size and dense packing of the brainstem nuclei make their connectivity challenging to reconstruct. Furthermore, an intrinsic limitation of tractography is that it is undirected, meaning that it is unable to identify the way a connection runs between two regions, resulting in symmetric connectivity matrices (i.e., connectomes). To address these limitations, this work aimed to build a directed, anatomically- informed, structural connectome of the brainstem and to use it as reference to quantify how faithfully diffusion tractography reconstructs brainstem connectivity. To reach the first main goal, the reference structural connectome of the brainstem was assembled capturing intrinsic brainstem connectivity as well as its connectivity with other subcortical structures. The evidence used, derived from an extensive literature review of viral tracing studies conducted in humans, non-human primates and rodents. The resulting directed connectome of the brainstem was then characterized using graph theory measures, which demonstrated that it captures biologically meaningful roles, distinguishing neuromodulatory output hubs such as the locus coeruleus and relay hubs such as the periaqueductal gray and ventral tegmental area. Furthermore, to evaluate the second aim and quantify the reliability of tractography reconstruc- tions, a subject-specific atlas was built at two different isotropic resolutions (1.5 mm and 0.8 mm) and seven diffusion tractography configurations were compared against the previously assembled reference connectome. These seven configurations differed in their anatomical constraints and reconstruction parameters, such as the use of anatomical constraints (ACT vs no-ACT), the FOD amplitude threshold below which streamline tracking is terminated (0.05 vs 0.06), the seeding strategy (gray matter-white matter interface vs dynamic), the tracking algorithm (probabilistic vs deterministic) and the voxel resolution (1.5 vs 0.8 mm). Two tractography configurations stood out, depending on whether the goal was to recover the largest number of true connections or to achieve the best balance between true and false positive connections. The tractography configuration with the default cutoff (FOD = 0.05) recovered the largest number of true positive connections (63.89%). On the other side the configuration using dynamic seeding gave the best balance between true and false positive connections. Across all configurations, the smallest nuclei were continuously under-reconstructed, with region size emerging as a possible predictor of reconstruction failure. Together, these results provide an anatomically grounded reference for the brainstem connectome preserving the connection directionality that tractography cannot recover and a quantitative assessment of how faithfully tractography reproduces it.

Il tronco encefalico è una regione del cervello umano caratterizzata da un’elevata complessità strutturale e funzionale. Contiene numerosi nuclei da cui originano estese proiezioni neuro- modulatorie e sensorimotorie, che raggiungono sia altri nuclei del tronco encefalico sia regioni corticali, sottocorticali e cerebellari. La sua connettività può essere studiata in vivo mediante la trattografia basata sulla risonanza magnetica di diffusione, che consente di ricostruire i tratti assonali della sostanza bianca. Tuttavia, le ridotte dimensioni dei nuclei del tronco encefalico e la loro stretta prossimità anatomica rendono difficoltosa la ricostruzione delle loro connessioni. La trattografia, inoltre, non consente di stabilire la direzione delle connessioni tra due regioni e restituisce quindi matrici di connettività simmetriche. Per affrontare queste limitazioni, il presente lavoro si è proposto di costruire un connettoma strutturale orientato del tronco encefalico, basato su evidenze anatomiche, e di utilizzarlo come riferimento per quantificare la fedeltà con cui la trattografia ricostruisce la connettività. Per conseguire il primo obiettivo, è stato costruito un connettoma strutturale di riferimento che include sia le connessioni interne al tronco encefalico sia quelle con altre strutture sottocorticali. Le evidenze utilizzate sono state ricavate da un’ampia revisione della letteratura relativa a studi di tracciamento virale condotti nell’uomo, nei primati non umani e nei roditori. Il connettoma orientato così ottenuto è stato quindi caratterizzato mediante misure di teoria dei grafi. Queste analisi hanno mostrato che il connettoma riflette ruoli biologicamente significativi, distinguendo hub di efferenza neuromodulatoria, come il locus coeruleus, e hub di relais, come la sostanza grigia periacqueduttale e l’area tegmentale ventrale. Per conseguire il secondo obiettivo e quantificare l’affidabilità della trattografia, è stato impie- gato un atlante specifico per un soggetto a due diverse risoluzioni isotrope (1,5 mm e 0,8 mm), e sette configurazioni di trattografia sono state confrontate con il connettoma di riferimento precedentemente costruito. Le configurazioni differivano per i vincoli anatomici e i parametri di ricostruzione: la presenza o l’assenza di vincoli anatomici (ACT vs no-ACT), la soglia di ampiezza della distribuzione degli orientamenti delle fibre (FOD) al di sotto della quale viene interrotta la propagazione delle streamline (0,05 vs 0,06), la strategia di inizializzazione delle streamline, o seeding (interfaccia materia bianca-materia grigia vs dinamica), l’algoritmo di tracciamento (probabilistico vs deterministico) e la risoluzione dei voxel (1,5 mm vs 0,8 mm). Due configurazioni si sono distinte, a seconda che l’obiettivo fosse ricostruire il maggior numero di connessioni vere oppure ottenere il miglior equilibrio tra veri positivi e falsi positivi. La con- figurazione con la soglia FOD predefinita di 0,05 ha ricostruito il maggior numero di connessioni vere positive (63,89%). La configurazione con seeding dinamico ha invece mostrato il miglior equilibrio tra veri positivi e falsi positivi. In tutte le configurazioni, la connettività dei nuclei più piccoli è risultata sistematicamente sottorappresentata nelle ricostruzioni, e le dimensioni delle regioni sono emerse come un possibile fattore predittivo della mancata ricostruzione delle connessioni anatomiche. Nel complesso, questi risultati forniscono un connettoma di riferimento del tronco encefalico basato su evidenze anatomiche, che integra la direzionalità delle connessioni, non direttamente ricavabile dalla trattografia, e una valutazione quantitativa della capacità con cui la trattografia riproduce la connettività anatomica.